幽门螺杆菌47kDa微孔蛋白基因的克隆表达及特性鉴定

目的对人幽门螺杆菌(H.pylori)编码47kDa外膜微孔蛋白基因omp47克隆表达及特性鉴定,探索研制H.pylori疫苗的新途径。方法培养和收集H.pylori标准菌株NTTC11637及临床菌株,采用酚∶氯仿抽提、纯化基因组DNA。设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增omp47基因片断。将目的基因和与克隆载体PGEM-T连接后,转化至E.coli DH5α及BL21,碱裂解提取质粒经BamHI和XhoI双酶切鉴定并进行序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定、镍亲和层析纯化检测抗原活性。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片断为1284bp,编码427个氨基酸。与GenBank公布的H.pylori标准株26695、43504及J99序列比对,核苷酸同源性高达94%~96%,编码氨基酸同源性96%~99%。经SDS-PAGE检测,电泳图谱上显示一条相对分子量为47kda的新生蛋白带。Western blot检测表明重组蛋白有较好的抗原性。结论成功克隆了外膜微孔蛋白OMP47的编码基因,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。