建立SYBRGreen实时RT-PCR定量检测大鼠I型胶原mRNA水平方法

目的:基于双链嵌合荧光染料SYBRGreenI,建立一种快速、灵敏的检测大鼠I型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法:提取大鼠肝脏总RNA,RT-PCR扩增I型胶原基因部分片段,将其克隆入pMD18-T载体用作参比品.基于SYBRGreenI双链嵌合染料建立检测大鼠I型胶原mRNA表达水平方法.其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性.结果:重组质粒构建成功,经测序鉴定,目的片段已插入pMD18-T载体内.所建立的实时RT-PCR方法的最低检测限度为1个拷贝/反应,在每反应100~107拷贝范围内,CT值(C代表cycle,T代表threshold;CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数)与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.991.结论:所建立的基于SYBRGreenI双链嵌合染料的大鼠I型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于进一步的各种组织的大量样本检测.