人透明质酸酶真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的构建人透明质酸酶真核表达载体,并将其转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。方法根据已知的天然人透明质酸酶PH20的氨基酸序列,利用PCR技术,将其克隆至真核表达载体MO2中,得到表达质粒MO2/ph20。经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418(800μg/mL)筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,SDS-PAGE法检测重组人透明质酸酶的蛋白表达水平,利用3,5-二硝基水杨酸法检测筛选得到的4个阳性细胞克隆的生物活性。结果成功构建了MO2/ph20真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因。重组人透明质酸酶表观相对分子质量约为70×103,4个阳性细胞克隆的酶活性均高于9000 U/L,其中MO2/ph20-4细胞株酶活性高达10 000 U/L以上。结论本研究成功构建了能够正确表达人透明质酸酶基因的真核表达载体MO2/ph20,并获得了有生物活性的重组人透明质酸酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人透明质酸酶奠定了基础。