Évolution des souches de Rotavirus du groupe A en circulation en Tunisie sur une période de trois ans (2005–2007)

Résultats Le RV a été retrouvé dans 323 échantillons de selles parmi 1503 (21 %). Les électrophorétypes longs ont prédominé en Tunisie tout au long de la période d’étude ( n = 158 versus n = 82 électrophorétypes courts). Le génotypage VP7 a permis la mise en évidence de cinq génotypes différents : G1, G2, G3, G4 et G9. Les résultats du typage VP4 ont montré une cocirculation des génotypes P[8], P[4], P[6] et P[11]. L’association G3P[8] était prédominante en Tunisie en 2005 et 2006, cédant la place aux souches G2P[4] en 2007. Abstract Background Rotaviruses are the most frequent agents associated with diarrhoea in children worldwide. Analysis of mobility of the 11 segments of genomic RNA by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) yields a pattern which is characteristic for a particular rotavirus isolate. The group A rotaviruses can be further characterized by analysis of VP7 and VP4 genes specificities, responsible for rotavirus classification into G and P genotypes, respectively. The aim of the present study was to determine the evolution of group A Rotavirus strains circulating in Tunisia over a 3-year period (2005–2007). Material and methods A total of 1503 stool samples collected from children less than five years old, consulting or hospitalised in Tunisia for diarrhoea between 2005 and 2007, were screened for the presence of group A Rotaviruses. Rotavirus-positive specimens were further analyzed by PAGE and G/P-genotyped by multiplex semi-nested RT-PCR. Results Rotaviruses were detected in 323 stool samples over 1503 (21 %). Long electropherotypes predominated in Tunisia during the whole period of study ( N = 158 vs N = 82 short electropherotypes). VP7 genotyping showed the cocirculation of five different genotypes: G1, G2, G3, G4 and G9. VP4 typing detected four different P-genotypes: P[8], P[4], P[6] and P[11]. Rotavirus strains with G3P[8] specificity were predominating in Tunisia in 2005 and 2006, replaced by G2P[4] strains in 2007. Mots clés Rotavirus Gastroentérite Électrophorétype Génotypage VP7 VP4 Keywords Rotavirus Gastroenteritis Electropherotype Genotyping VP7 VP4 1 Introduction Les Rotavirus (RV) constituent le principal agent étiologique des gastroentérites infantiles. Le génome des RV est constitué de 11 fragments d’ARN bicaténaire. Le caractère segmenté de l’ARN viral favorise les réassortiments et explique la variabilité de ces virus. L’analyse du génome viral peut être réalisée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour caractériser les souches en circulation lors des épidémies. La variabilité des déterminants antigéniques portés par les protéines VP7 et VP4 des RV, ainsi que de celle des gènes qui les codent, a permis de générer une classification de ces virus en génotypes G et P. Au moins 15 génotypes G et 23 génotypes P ont pu être décrits, réalisant une multitude d’associations G/P [1,2] . Une technique de RT-PCR semi-nichée multiplex, basée sur l’amplification au moyen d’amorces spécifiques de type, est utilisée pour le génotypage G et P. Des études réalisées partout dans le monde sur les souches de RV en circulation ont montré que les associations les plus communes dans le monde sont : G1P[8], G2P[4], G3P[8] et G4P[8] [3] . Ces études d’épidémiologie moléculaire ont permis la réalisation de progrès considérables dans l’élaboration de vaccins anti-RV. Ainsi, en 2006, deux vaccins anti-RV ont été commercialisés : le premier est un vaccin oral, vivant pentavalent réassortant humain-bovin (WC3) (RotaTeq, Merck) contenant les génotypes G1, G2, G3, G4 et P[8] ; le second est un vaccin humain vivant atténué contenant la souche RIX4414 de spécificité G1P[8] (Rotarix, Glaxo Smith Kline Biologicals). Cependant, bien que les génotypes G1 à G4 soient les plus répandus dans le monde, certains génotypes tels que les génotypes G9, non inclus dans les vaccins, sont actuellement en émergence partout dans le monde [4–12] . L’émergence de nouveaux génotypes ainsi que le manque de données concernant l’efficacité des vaccins actuels contre les souches émergentes incitent à continuer la surveillance des infections à RV avant et après l’introduction des vaccins. Seule une telle surveillance permettra aux responsables nationaux de la santé de contrôler l’impact des programmes de vaccination sur la circulation des génotypes ainsi que sur l’émergence de souches non communes. Le principal objectif du présent travail était de suivre l’évolution des souches de RV du groupe A en circulation en Tunisie sur une période de trois ans, de 2005 à 2007. 2 Matériel et méthodes 2.1 Matériel L’enquête a porté sur 1503 échantillons de selles provenant d’enfants de moins de cinq ans consultant ou hospitalisés en pédiatrie ou néonatologie pour diarrhée. Il s’agit d’une étude prospective menée sur des échantillons collectés depuis le 1 er janvier 2005 jusqu’au 31 décembre 2007. La collecte des selles a été effectuée au niveau de huit différents CHU tunisiens, couvrant ainsi le territoire national du nord au sud. Le prélèvement, effectué à la phase aiguë de la maladie, consistait à recueillir 2 à 3 g (ou 2 à 3 ml) de selles dans un récipient stérile à fermeture hermétique. Le prélèvement a alors été acheminé au laboratoire où il a été conservé jusqu’à son analyse à +4 °C pendant moins de 72 heures, ou à –20 °C pour une conservation plus longue. 2.2 Méthodes 2.2.1 Détection des RV du groupe A Pour la détection des RV dans les échantillons de matières fécales, on a procédé à un test immunoenzymatique (IDEIA Rotavirus, DAKO Ltd., Glostrup, Danemark) utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre des protéines spécifiques des RV du groupe A, notamment la protéine de la capside interne VP6. Il s’agit d’un test qualitatif de type Elisa sandwich pouvant être lu à l’œil nu ou par spectrophotométrie. 2.2.2 Extraction de l’ARN viral par le TRI-Reagent ® L’ARN viral a été extrait à l’aide du TRI-Reagent ® (Sigma) selon la méthode décrite par Chomczynski et Sacchi [13] . 2.2.3 Mise en évidence du génome viral par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) La PAGE a utilisé deux gels à concentrations différentes d’acrylamide : un premier gel de résolution à 10 % de polyacrylamide, permettant une bonne séparation entre les différents segments du génome viral, et un second gel de concentration à 3 % de polyacrylamide. Chaque extrait est déposé sur le gel avec du bleu de migration contenant du bleu de bromophénol et du glycérol. La migration est réalisée dans le tampon Tris–glycine pendant 22 heures à 100 V. La révélation a été effectuée par coloration argentique, suite à quoi le gel a été séché entre deux feuilles de cellophane et mis dans un sécheur de gel pendant 90 minutes. 2.2.4 Typage moléculaire des souches de Rotavirus 2.2.4.1 Dénaturation de l’ARN double brin et fixation des amorces externes sur l’ARN simple brin À 5 μl d’extrait d’ARNdb (environ 200 nmol) placé dans un tube Eppendorf ont été ajoutés 1 μM de chaque amorce sens et antisens et 3 μl d’eau DEPC. Le mélange a été placé dans le thermocycleur à 97 °C pendant 5 minutes, puis immédiatement refroidi dans de la glace [14,15] . 2.2.4.2 Transcription inverse À la solution ayant subi le choc thermique sont ajoutés 40 μl d’un mélange réactionnel comprenant : 24 μl d’eau DEPC, 2 mM de dNTP, 5 μl du tampon de la reverse transcriptase (10 ×), 2 mM de DTT (Dithiothréitol), 4 mM de MgCl 2  et 0,05 U de la Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT, Promega ® ). Les tubes sont alors placés dans le thermocycleur à 42 °C pendant 45 minutes. 2.2.4.3 Première PCR Le produit de la RT est utilisé dans sa totalité en lui ajoutant : 25,7 μl d’eau distillée stérile, 20 μl de tampon pour Taq polymérase (10 ×), 0,2 mM de dNTP, 0,25 mM de MgCl 2  et 1,5 U de Taq polymérase (Go-Taq, Promega ® ). L’ADNc subit une réaction de polymérisation en chaîne comportant 30 cycles constitués chacun d’une étape de dénaturation pendant une minute à 95 °C, d’une étape d’hybridation pendant 1 minute à 42 °C et d’une élongation pendant une minute à 72 °C. Ces cycles sont précédés par une étape de dénaturation pendant cinq minutes à 95 °C, puis suivis par une étape d’élongation qui dure sept minutes à 72 °C. 2.2.4.4 PCR semi-nichée multiplex Le produit de la première amplification subit une seconde amplification par PCR semi-nichée multiplex utilisant un ensemble d’amorces internes au gène choisi dans les régions variables les mieux conservées dans un même génotype, permettant l’amplification d’un fragment dont la taille est spécifique du génotype [14,15,16] . La quantité d’ADN utilisée dans cette étape dépend de l’intensité de la bande après la première amplification : elle varie ainsi entre 0,5 μl, lorsque la bande est intense, et 6 μl, en cas d’absence de bande. À cette quantité sont ajoutés 0,5 mM de MgCl 2 , 0,2 mM de dNTP, 0,2 μM de chaque amorce, 10 μl de tampon PCR 10 ×, 1,5 U de Taq polymérase et un volume d’eau stérile suffisant pour obtenir un volume final de 50 μl. La mixture doit être préparée dans de la glace, puis placée dans le thermocycleur pour une seconde amplification selon le même protocole que celui utilisé précédemment. 2.2.4.5 Révélation des produits de la PCR Les produits d’amplification ainsi qu’un marqueur de poids moléculaire (100 bp ladder  ; Promega ® ) ont subi une électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % contenant 0,0015 % de bromure d’éthidium (BET) dans un tampon de migration Tris–Borate–EDTA (TBE). La visualisation des bandes d’ADN est faite sous lumière ultraviolette. 3 Résultats 3.1 Taux de détection des RV Le RV a été retrouvé dans 323 échantillons de selles parmi 1503 (21 %). La répartition des échantillons positifs selon les années était comme suit : 69 selles positives sur 324 en 2005 (21,3 %) ; 106 selles positives sur 614 en 2006 (17,4 %) ; 148 selles positives sur 565 en 2007 (26,2 %). 3.2 Évolution des électrophorétypes de Rotavirus du groupe A entre 2005 et 2007 en Tunisie Sur les 323 selles positives en Elisa, 244 (75,5 %) ont été positives en PAGE. Au total, cinq profils électrophorétiques différents ont cocirculé pendant la période d’étude, dont deux étaient des électrophorétypes longs (L1 et L2) et trois étaient des électrophorétypes courts (S1, S2 et S3). Les électrophorétypes longs ont prédominé en Tunisie tout au long de la période d’étude ( n = 158 versus n = 82 électrophorétypes courts) ( Fig. 1 ). Par ailleurs, quatre échantillons ont présenté un profil mixte, c’est-à-dire contenant un nombre de bandes supérieur à 11. 3.3 Évolution des génotypes VP7 Parmi les 323 selles positives, 316 (98 %) ont pu être typées en VP7, soit un taux de souches non typables de 8 %. Le génotypage VP7 a permis la mise en évidence de cinq génotypes différents : G1, G2, G3, G4 et G9 ( Tableau 1 ). Une grande hétérogénéité dans la distribution des génotypes VP7 a pu être mise en évidence. En 2005 et 2006, les souches de génotype G3 étaient prédominantes puis en 2007, c’est le génotype G2 qui a prédominé ( Fig. 2 ). 3.4 Évolution des génotypes VP4 Parmi les 323 selles positives, 287 (89 %) ont pu être typées en VP4. Le génotypage VP4 a permis la mise en évidence de quatre génotypes différents : P[4], P[6], P[8] et P[11], ainsi que de génotypes mixtes ( Tableau 1 ) avec des taux de détection variables d’une année à l’autre : le génotype prédominant était le génotype P[8] entre 2005 et 2006, laissant la place au génotype P[4] en 2007 ( Fig. 3 ). 3.5 Associations VP7/VP4 Au total, 286 (89 %) selles ont pu être génotypées simultanément en VP7 et VP4, permettant ainsi la mise en évidence de 17 types d’associations distinctes ( Tableau 1 ) ainsi qu’un taux considérable d’associations mixtes (50 souches, soit 17 % des souches G/P-typables). L’association G3P[8], prédominante en Tunisie, en 2005 et 2006, a cédé la place aux souches G2P[4] en 2007. Il était intéressant de noter que des associations inhabituelles ont pu être mises en évidence : G2P[8] et G3P[4]. 4 Discussion 4.1 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide La cocirculation de nombreux profils électrophorétiques, avec prédominance de l’un d’entre eux, a déjà été mise en évidence par de nombreux auteurs et elle est d’ailleurs considérée comme caractéristique de l’épidémiologie des infections à RV [17] . Par ailleurs, quatre échantillons ont présenté un profil mixte, c’est-à-dire contenant un nombre de bandes supérieur à 11. Ces profils mixtes ont précédemment été rapportés dans plusieurs études [18,19] . Particulièrement fréquents en période d’épidémie, ces profils témoignent d’infections mixtes chez un même enfant et peuvent résulter en la survenue de réassortiments. 4.2 Évolution des génotypes VP7 en circulation La présente étude a permis de mettre en évidence une évolution très dynamique des génotypes G de RV au cours des années. En 2005, le génotype G3 est devenu le génotype prédominant en Tunisie aux dépens du génotype G1, jusque-là largement majoritaire depuis 1995 [20] . Le génotype G3, absent en Tunisie entre 1995 et 1999, avait initialement été détecté entre 2000 et 2004 sous forme de quelques cas sporadiques [20] . En 2007, on a assisté à une nette augmentation des souches de génotype G2, ce génotype étant devenu le génotype le plus fréquemment isolé en Tunisie (52 % des cas). Le génotype G2 a été rapporté entre 1996 et 1998 en Argentine [18] et en Inde [21] avec des prévalences de 43 % et 22 %, respectivement. Durant la période 2006–2007, le génotype G4, rarement détecté en Tunisie entre 1995 et 2004 [20] , a également commencé à s’étendre, avec des taux de détection de 7 % et 9 % en 2006 et 2007, respectivement. Les génotypes (G2, G3 et G4) font partie des génotypes les plus répandus partout dans le monde, après le génotype G1 et circulent selon des proportions variables d’une région à une autre et d’une période à l’autre [4–12] . En 2004, des souches de génotype G9 ont été isolées pour la première fois en Tunisie [20] . Leur détection s’est poursuivie en Tunisie dans la période 2005–2007. La mise en évidence des souches G9 de RV du groupe A avait auparavant été rapportée dans plusieurs études africaines [6,11,22] . Ce génotype G9 a été décrit jusqu’ici essentiellement dans les infections humaines et plus rarement dans les infections animales [23] . 4.3 Évolution des génotypes VP4 en circulation En 2005, les génotypes P[4], P[6] et P[8] ont cocirculé en Tunisie. Ces trois génotypes sont les génotypes VP4 les plus souvent isolés au niveau mondial. La prédominance du génotype P[8] observée en 2005–2006 a confirmé les résultats de la précédente étude tunisienne, puisque ce génotype était également prédominant en Tunisie entre 1995 et 2004 [20] . Toutefois, en 2007, on a vu la prédominance du type P[4] (39 % de P[4] versus 22 % de P[8]), celui-ci ayant été détecté selon un taux très faible durant les années précédentes. D’après les données de la littérature, le génotype P [8] constitue le type VP4 prédominant au niveau mondial : au Japon (97,4 %) [24] , en Tanzanie (83,7 %) [25] , en Inde (31 %) [21] , au Brésil (98,9 %) [19] et en Irlande (78 %) [26] . En revanche, d’après une étude réalisée en Argentine [18] , le génotype P [4] était le type prédominant (71 %). Durant la période 2006–2007, on a constaté l’émergence en Tunisie d’un nouveau génotype VP4 : le génotype P [11] (8 % et 16 % des cas en 2006 et 2007, respectivement). Néanmoins, un séquençage de ces souches reste indispensable afin de confirmer ce résultat préliminaire. Le génotype P [11] est actuellement en émergence dans certaines régions du monde : deux études indiennes ont retrouvé ce génotype avec des taux de détection de 3 % et 8,5 % [21,27] et il a été décrit en Indonésie avec une prévalence de 0,5 % [28] . 4.4 Association des génotypes VP7/VP4 L’association G1P[8] était prédominante en Tunisie entre 1995 et 2004 [20]  ; cette association fait partie des associations les plus communes partout dans le monde. En 2005 et 2006, G1P [8] a cédé la place aux associations G3P[8], puis aux souches G2P[4] en 2007. Il s’agissait dans tous ces cas de combinaisons stables faisant intervenir des génotypes avec affinités puissantes les uns envers les autres : en effet, d’après les données de la littérature [29,30] , le génotype P [4] est communément lié au génotype G2, alors que le génotype P[8] est souvent associé aux génotypes G1, G3 et G4. Pourtant, nous avons pu mettre en évidence la circulation de souches de RV présentant des associations VP7/VP4 non communes, telles que G2P[8] et G3P[4]. L’existence de telles associations a précédemment été rapportée dans d’autres travaux : elle témoigne de la grande variabilité des RV et de l’éventualité de réassortiments au sein des souches [3,31] . Peu de données concernant le génotype P[11] sont disponibles dans la littérature. Une étude réalisée en Inde, où le génotype P[11] correspond à un des génotypes VP7 majoritaires, a montré que les génotypes P[11] étaient toujours associés aux génotypes G10. Dans la présente étude, au niveau de laquelle les génotypes G10 n’ont pas été recherchés, les souches de génotype P[11] ont été retrouvées en association aussi bien avec les génotypes G1 à G4 qu’avec les génotypes G9 [21,27] . Dans la présente étude, les souches G9 ont été retrouvées en association avec les génotypes VP4 P[8], P[6] et P[11]. D’après les données de littérature, elles ont déjà été rapportées en association avec ces différents génotypes VP4, ainsi qu’avec les génotypes P[4] et P[19], mais l’association la plus fréquemment retrouvée reste celle avec les génotypes P[8] [32–35] . La proportion des infections mixtes dans le présent travail était considérable (17 %). Ce résultat est néanmoins similaire à celui rapporté dans plusieurs études réalisées dans des pays en développement, notamment au Brésil (29 %) [36] , en Inde (21 %) [21] et au Bangladesh (17 %) [37] . La grande fréquence des infections mixtes favorise l’émergence continue de nouvelles souches. 5 Conclusion Il semblerait que la diversité génétique des souches en circulation dans les pays en développement soit particulièrement élevée : la cohabitation entre Homme et bétail, fréquente dans ces pays, favoriserait l’apparition et la pérennité de nouvelles souches non communes [21,37] . L’émergence des souches G9P[8] en Tunisie confirme que de telles souches sont en cours d’extension au niveau mondial où elles sont signalées de plus en plus fréquemment. Bien que les souches G9P[8] ne sont pas incluses dans les vaccins actuellement commercialisés, la présence du génotype P[8] pourrait expliquer l’immunité hétérotypique observée dans les essais cliniques réalisés [38–41] . Cependant, la réponse immunitaire spécifique de génotype semble assurer une meilleure protection que la réponse hétérologue et la vigilance reste donc de rigueur : il semble primordial de continuer à analyser le changement des souches identifiées d’une année à l’autre, afin notamment de détecter d’éventuelles souches émergentes avant et après l’introduction du vaccin dans un pays [39,42,43] . 6 Conflits d’intérêts Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêt. Remerciements Le présent travail a été financé grâce au don V27/181/167 de l’OMS, EMRO. Références [1] M.K. Estes Rotaviruses and their replication Fields D.M. Knipe P.M. Howley R.M. Chanock al. et Fields virology 4th ed. 1996 Lippincott-Raven Press Philadelphia 1747 1785 [2] Rahman M, Matthijnssens J, Goegebuer T, De Leener K, Vanderwegen L, Van der Donck I, et al. Predominance of rotavirus G9 genotype in children hospitalized for rotavirus gastroenteritis in Belgium during 1999–2003. J Clin Virol 2005;33:1–6. [3] J.R. Gentsch P.A. Woods M. Ramachandran B.K. Das J.P. Leite A. Alfieri Review of G and P typing results from a global collection of rotavirus strains: implication for vaccine development J Infect Dis 174 1996 S30 S36 [4] M. Iturriza-Gomara D. Cubitt A.D. Steele J. Green D. Brown G. Kang Characterisation of rotavirus G9 strains isolated in the UK between 1995 and 1998 J Med Virol 61 2000 510 517 [5] N.A. Cunliffe W. Dove J.E.G. Bunn M. Ben Ramadam J.W. Nyangao R.L. Riveron Expanding global distribution of rotavirus serotype G9: Detection in Libya Emerg Infect Dis 7 2001 890 892 [6] A.D. Steele L. Nimzing I. Peenze M.C. De Beer A. Geyer I. Angyo Circulation of the novel G9 and G8 rotavirus strains in Nigeria in 1998/1999 J Med Virol 67 2002 608 612 [7] C. Kirkwood N. Bogdanovic-Sakran E. Palombo P. Masendycz H. Bugg G. Barnes Genetic and antigenic characterization of rotavirus serotype G9 strains isolated in Australia between 1997 and 2001 J Clin Microbiol 41 2003 3649 3654 [8] A.R. Laird J.R. Gentsch T. Nakagomi O. Nakagomi R.I. Glass Characterization of serotype G9 rotavirus strains isolated in the United States and India from 1993 to 2001 J Clin Microbiol 41 2003 3100 3111 [9] V. Martella V. Terio G. Del Gaudio M. Gentile P. Fiorente S. Barbuti Detection of the emerging rotavirus G9 serotype at high frequency in Italy J Clin Microbiol 41 2003 3960 3963 [10] N. Santos E.M. Volotao C.C. Soares M.C. Albuquerque F.M. da Silva V. Chizhikov VP7 gene polymorphism of serotype rotavirus strains and its impact on G genotype determination by PCR Virus Res 93 2003 127 138 [11] A.D. Steele B. Ivanoff Rotavirus circulating in Africa during 1996–1999: Emergence of G9 strains and P[6] strains Vaccine 21 2003 361 367 [12] P.M. Heaton M.G. Goveia J.M. Miller P. Offit H.F. Clark Development of a pentavalent rotavirus vaccine against prevalent serotypes of rotavirus gastroenteritis J Infect Dis 192 2005 17 21 [13] P. Chomczynski N. Sacchi Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thyocianate–phenol–chloroform extraction Anal Biochem 162 1987 156 159 [14] V. Gouvea R.I. Glass P. Woods K. Taniguchi H.F. Clark B. Forrester Polymerase chain reaction amplification for typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens J Clin Microbiol 28 1990 276 282 [15] J.R. Gentsch R.I. Glass P. Woods V. Gouvea M. Gorziglia J. Flores Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction J Clin Microbiol 30 1992 1365 1373 [16] M. Iturriza-Gomara J. Green D.W.G. Brown U. Desselberger J.J. Gray Diversity within the VP4 gene of rotavirus P[8] strains: Implications for reverse transcription-PCR genotyping J Clin Microbiol 38 2000 898 901 [17] A.D. Steele Y.N. Mnisi M.M. Williams P. Bos S. Aspinall Electrophoretic typing of nosocomial rotavirus infection in a general paediatric unit showing the continual introduction of community strains J Med Virol 40 1993 126 132 [18] M.H. Argüelles G.A. Villegas A. Castello A. Abrami P.D. Ghiringhelli L. Semorile VP7 and VP4 genotyping of human group A Rotavirus in Buenos Aires, Argentina J Clin Microbiol 38 2000 252 259 [19] K. Serravalle N. Santos S.I. Sardi S.P. Silva C. Ribeiro Junior Hda A.P. Mattos Molecular characterization of group A Rotavirus isolates obtained from hospitalized children in Salvador, Bahia, Brazil Braz J Infect Dis 11 2007 35 39 [20] A. Chouikha I. Fodha S. Noomen L. Bouzid M. Mastouri I. Peenze Group A rotavirus strains circulating in the eastern center of Tunisia during a ten-year period (1995–2004) J Med Virol 79 2007 1002 1008 [21] V. Jain B.K. Das M.K. Bhan R.I. Glass J.R. Gentsch Great diversity of group A rotavirus strains and high prevalence of mixed rotavirus infections in India J Clin Microbiol 39 2001 3524 3529 [22] Armah GE, Steele AD, Binka FN, Esona MD, Asmah RH, Anto F, et al. Changing patterns of rotavirus genotypes in Ghana: Emergence of human rotavirus G9 as a major cause of diarrhoea in children. J Clin Microbiol 2003;41:2317–22. [23] Y. Hoshino A.Z. Kapikian Classification of rotavirus VP4 and VP7 serotypes Arch Virol 12 1996 99 111 [24] T.G. Phan P. Khamrin T.D. Quang S.K. Dey S. Takanashi S. Okitsu Detection and genetic characterization of group A Rotavirus strains circulating among children with acute gastroenteritis in Japan J Virol 81 2007 4645 4653 [25] Moyo SJ, Gro N, Kirsti V, Matee MI, Kitundu J, Maselle SY, et al. Prevalence of enteropathogenic viruses and molecular characterization of group A rotavirus among children with diarrhea in Dar es Salaam, Tanzania. BMC Public Health 2007;7:359. [26] J. O’Mahony B. Foley S. Morgan VP7 and VP4 genotyping of rotavirus samples recovered from infected children in Ireland over a 3-year period J Clin Microbiol 37 1999 1699 1703 [27] I. Banerjee S. Ramani B. Primrose P. Moses M. Iturriza-Gomara J.J. Gray Comparative study of the epidemiology of Rotavirus in children from a community-based birth cohort and a hospital in South India J Clin Microbiol 44 2006 2468 2474 [28] Putnam SD, Sedyaningsih ER, Listiyaningsih E, Pulungsih SP, Komalarini, Soenarto Y, et al. Group A rotavirus-associated diarrhea in children seeking treatment in Indonesia. J Clin Virol 2007;40:289–94. [29] Gentsch JR, Laird A, Bielfelt B, Griffin DD, Banyai K, Ramachandran M, et al. Serotype diversity and reassortment between human and animal rotavirus strains: Implication for rotavirus vaccine programs. J Infect Dis 2005;192:S146–59. [30] N. Santos Y. Hoshino Global distribution of rotavirus serotypes/genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine Rev Med Virol 15 2005 29 56 [31] N.A. Cunliffe J.S. Gondwe R.L. Broadhead M.E. Molyneux P.A. Woods J.S. Bresee Rotavirus G and P types in children with acute diarrhea in Blantyre, Malawi, from 1997 to 1998: predominance of novel P[6]G8 strains J Med Virol 57 1999 308 312 [32] M.I. Adah A. Wade K. Taniguchi Molecular epidemiology of rotaviruses in Nigeria: Detection of unusual strains with G2P[6] and G8P[1] specificities J Clin Microbiol 39 2001 3969 3975 [33] N. Santos E.M. Volotao C.C. Soares M.C. Albuquerque F.M. da Silva T.R. de Carvalho Rotavirus strains bearing genotype G9 or P[9] recovered from Brazilian children with diarrhea from 1997 to 1999 J Clin Microbiol 39 2001 1157 1160 [34] Ramachandran M, Kirkwood CD, Unicomb L, Cunliffe NA, Ward RL, Bhan MK, et al. Molecular characterization of serotype G9 rotavirus strains from a global collection. Virology 2000;278:436–44. [35] Zhou Y, Supawadee J, Khamwan C, Tonusin S, Peerakome S, Kim B, et al. Characterization of rotavirus serotype G9 isolated in Japan and Thailand from 1995 to 1997. J Med Virol 2001;65:619–28. [36] Timenetsky MdoC N. Santos V. Gouvea Survey of rotavirus G and P types associated with human gastroenteritis in Sao Paulo, Brazil, from 1986 to 1992 J Clin Microbiol 32 1994 2622 2624 [37] L.E. Unicomb G. Podder J.R. Gentsch P.A. Woods K.Z. Hasan A.S. Faruque Evidence of high-frequency genomic reassortment of group A rotavirus strains in Bangladesh: Emergence of type G9 in 1995 J Clin Microbiol 37 1999 1885 1891 [38] K.Y. Green K. Taniguchi E.R. Mackow A.Z. Kapikian Homotypic and heterotypic epitope-specific antibody responses in adult and infant rotavirus vaccines: Implications for vaccine development J Infect Dis 161 1990 667 679 [39] Kang JO, Kilgore P, Kim JS, Nyambat B, Kim J, Suh HS, et al. Molecular epidemiological profile of rotavirus in South Korea, July 2002 through June 2003: Emergence of G4P[6] and G9P[8] strains. J Infect Dis 2005;192:S57–63. [40] Ruiz-Palacios GM, Perez-Schael I, Velazquez FR, Abate H, Breuer T, Clemens SC, et al. Safety and efficacy of an attenuated vaccine against severe rotavirus gastroenteritis. N Engl J Med 2006;354:11–22. [41] T. Vesikari D.O. Matson P. Dennehy P. Van Damme M. Santosham Z. Rodriguez Safety and efficacy of a pentavalent human-bovine (WC3) reassortant rotavirus vaccine N Engl J Med 354 2006 23 33 [42] Y. Hoshino A.Z. Kapikian Rotavirus serotypes: Classification and importance in epidemiology, immunity, and vaccine development J Health Popul Nutr 18 2000 5 14 [43] R.I. Glass J.S. Bresee U.D. Parashar B. Jiang J. Gentsch The future of rotavirus vaccine: A major setback leads to new opportunities Lancet 363 2004 1547 1550