乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的构建含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因的真核表达载体,为探讨HBV X基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系提供实验依据。方法用PCR方法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列,对pcDNA3.1(+)载体及X基因PCR产物双酶切,用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HBV X基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx。用梭华-SofastTM基因转染试剂将其质粒转染THP-1巨噬细胞,细胞裂解液经SDS-PAGE及转硝酸纤维素膜后做Western blotting,鉴定目的蛋白。结果双酶切pcDNA3.1(+)-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为5.4 kb和465 bp片断,说明X亚克隆入pcDNA3.1(+),经序列测定其含有完整的X基因片段;Western blotting结果显示pcDNA3.1(+)-HBx能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx,并能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。