丝裂原活化蛋白激酶特异性小干扰RNA表达载体对结肠癌细胞周期和DNA甲基化的影响

目的构建丝裂原活化蛋白激酶(MEK)基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察其静默效应及对结肠癌细胞SW1116生长周期和DNA甲基化的影响。方法选择MEK不同靶点寡核苷酸片段.克隆到pGCsilencer真核表达载体中。脂质体转染SW1116细胞,荧光显微镜评估转染效率,G418筛选稳定表达siRNA的细胞。Western印迹法检测siRNA对MEK蛋白表达的静默效果。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞生长活力,流式细胞术分析细胞周期,甲基化特异性PCR和DNA测序检测p16~(INK4A)基因启动子甲基化状态。结果构建2个靶点的MEK重组质粒,分别转染和联合转染SW1116细胞,转染效率约为72.1%,G418筛选培养2周得到稳定表达MEK siRNA的细胞,MEK蛋白抑制率分别为74.2%和69.1%和90.2%.下游分子ERK蛋白磷酸化水平随之降低;细胞增殖活力下降2～4倍和细胞周期阻滞于G1期,细胞周期负调控因子p16~(INK4A)启动子区呈低甲基化状态。结论MEK特异性siRNA表达载体对结肠癌细胞MEK蛋白表达有一定的静默效果,多靶点联合效果更好.阻滞细胞周期于G1期,促进p16~(INK4A)基因去甲基化。