靶向EGFR隐蔽表位的免疫毒素的制备及其对肿瘤细胞的特异性杀伤

目的:制备靶向表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)隐蔽表位(287-302)的免疫毒素,并鉴定其生物学功能。方法:通过基因工程方法将抗EGFR(287-302)的806单链抗体(806 single-chain antibody fragment,806scFv)基因经柔性肽与铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)的截短形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体pET-22b-806scFv-PE38KDEL并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经纯化获得该免疫毒素融合蛋白806scFv-PE38KDEL,ELISA和流式细胞术检测其与EGFR的结合活性,间接免疫荧光检测重组免疫毒素的内化作用,CCK-8法检测806scFv-PE38KDEL对人脑胶质瘤细胞U87MG和U87MG-EGFRvⅢ、表皮癌细胞A431、乳腺癌细胞MDA-MB-468、舌癌细胞CAL-27的细胞毒性。结果:成功构建重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL,诱导表达的蛋白806scFv-PE38KDEL以包涵体形式存在,经纯化后的纯度>95%,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定为目的蛋白。806scFv-PE38KDEL能EGFRvⅢ胞外段蛋白结合,还能与外源性表达EGFRvⅢ的肿瘤细胞和高表达EGFR的肿瘤细胞相结合,而与表达低水平EGFR的肿瘤细胞不结合。806scFv介导了重组免疫毒素的内化。806scFv-PE38KDEL对靶细胞有明显的杀伤作用,对过表达EGFRvⅢ的U87MG-EGFRvⅢ细胞IC50值为(5.85±0.03)ng/ml,对EGFR高表达细胞MDA-MB-468、A431、CAL-27的IC50值分别为(162.80±0.06)、(75.72±0.04)、(123.70±0.03)ng/ml。在1μg/ml的质量浓度下,相比PBS对照组,806scFv-PE38KDEL对U87MG-EGFRvⅢ、MDA-MB-468、A431和CAL-27细胞增殖的抑制率均显著增高[(98.67±0.07)%vs(2.45±2.85)%、(86.26±1.01)%vs(0.48±1.76)%、(96.72±0.16)%vs(1.33±1.31)%、(96.29±0.30)%vs(2.00±0.60)%,均P<0.01],而对U87MG细胞几乎没有抑制作用[(3.59±2.09)%vs(0.19±0.95),P>0.05]。结论:本研究所制备的靶向EGFR(287-302)表位的重组免疫毒素806scFv-PE38KDEL能特异地结合并杀伤EGFRvⅢ或EGFR高表达的肿瘤细胞。