人RASSF1A基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的应用pLV.Des3d.P/neo构建人RASSF1A基因的慢病毒表达载体并对其进行鉴定。方法采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的RASSF1A序列进行分析,设计一对RASSF1A基因上下游引物,利用Gateway克隆方法,分别在其两端添加attB重组位点,运用PCR扩增RASSF1A和IRES/eGFP,将PCR产物进行BP反应然后转化到Stbl3感受态菌,通过卡那霉素抗性筛选、PCR鉴定,选取鉴定正确的pDown-RASSF1A和pTail-IRES/eGFP克隆测序。将pDown-RASSF1A和pTail-IRES/eGFP与pLV.EX3d.P/neo混合进行LR反应,构建慢病毒载体pLV.EX3d.P/neo-EF1A>RASSF1A>IRES/eGFP,再次进行PCR、测序鉴定。结果成功地构建了hRASSF1A基因的重组慢病毒表达载体pLV.EX3d.P/neo-EF1A>RASSF1A>IRES/eGFP。结论基因序列克隆正确,为进一步探讨RASSF1A在肿瘤基因治疗中的作用奠定了基础。