稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立

为构建稳定表达T7RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coliBL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7。采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性。本研究建立稳定表达T7RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法。