Smad核转录共抑因子在人近端小管上皮细胞转分化中的表达及作用

目的:观察Smad核转录共抑因子(SnoN)在TGF-β1致人近端小管上皮细胞转分化过程中的表达,探讨SnoN蛋白对TGF-β1所致的小管上皮细胞转分化的作用.方法:体外培养的人近端小管上皮细胞(HK-2),随机分为正常对照组、TGF-β1(5 ng/ml)组和TGF-β1(5 ng/ml)+MG-132(5 μmol/ml)组.Western-blot检测细胞中SnoN蛋白水平的改变和Smad2/3磷酸化水平的改变;半定量RT-PCR方法观察细胞中SnoN mRNA表达的改变.免疫荧光检测间充质细胞标记物α-SMA的表达.结果:Western-blot的结果显示:(1)TGF-β1作用于细胞,SnoN蛋白表达迅速减少,10 min为对照组的38%,并呈时间依赖进行性减少,60 min较0 min降低89%(P<0.01),24 h有所恢复但仍较0 min明显降低(P<0.01);TGF-β1+MG-132组中SnoN蛋白表达与对照组差异无统计学意义,与TGF-β1组相比,SnoN蛋白水平明显上调.(2)半定量RT-PCR显示:TGF-β1作用于细胞后,与SnoN蛋白表达不同,SnoN mRNA迅速升高,60 min其表达增高近1倍(与0 min比较,P<0.01);TGF-β1+MG-132组中SnoNmRNA的表达与TGF-β1组差异无统计学意义.(3) TGF-β1诱导细胞10 min即可引发Smad2/3磷酸化(与0 min比较,P<0.01),随着作用时间的延长,细胞中磷酸化的Smad2/3蛋白表达水平逐渐升高,TGF-β1+MG-132组中,Smad2/3磷酸化蛋白的表达减少80 %(P<0.01).(4)TGF-β1作用于细胞24 h后免疫荧光检测到重新表达的α-SMA,TGF-β1+MG-132组α-SMA的表达被抑制.结论:TGF-β1可诱导SnoN mRNA表达上调,但SnoN蛋白的表达遭遇泛素系统的降解显著减少,SnoN蛋白水平的下调可能是TGF-β1导致小管上皮细胞纤维化作用的必要条件.