四环素调控HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶表达细胞系的建立

目的建立双稳定表达HCV NS3/4A蛋白酶的HepG2细胞系。方法将pTET-ON质粒转染HepG2细胞后用G418压力选择,利用Tet反应性质粒pTER2luc筛选高表达、低背景的TET-ON稳定转染的细胞。HindⅢ单切pMD18T-NS3/4A,平端化后再用BamHⅠ单切,然后与用BamHⅠ与EcoRⅤ双切的pTER2hyg质粒连接,转化菌株JM109感受态细胞,获得重组质粒pTER2hyg-NS3/4A,经PCR鉴定及序列测定。将pTER2hyg-NS3/4A用脂质体法转染TET-ON稳定转染HepG2细胞,经持续潮霉素压力选择和克隆化获稳定转染的细胞系,用实时荧光RT-PCR筛选出高水平表达NS3/4A的细胞株,并用Western blot验证。结果成功建立了双稳定的可诱导表达NS3/4A蛋白酶的HepG2细胞株。结论本研究构建的细胞株为建立以细胞为基础的抗HCV药物筛选系统提供了有效的筛选细胞系。