牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究

牛支原体(Mycoplasma bovis)是感染牛的一种重要的致病性病原体。本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法。该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60min即可完成反应。LAMP方法能检测出20pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性。本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测。临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤。在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95%)高于PCR方法检测出阳性率(19.16%),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测。研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用。