CARATTERIZZAZIONE DELLA COMPONENTE FENOLICA IN BASILICO MEDIANTE HPLC/MS E TANDEM MS

Al basilico (Ocimum basilicum L.) è riconosciuta un importante valenza di funzionalità salutistica grazie alla presenza di composti ad attività antiossidante, tra cui numerosi polifenoli appartenenti essenzialmente a due classi di composti: i derivati dell'acido idrossicinnamico ed i flavonoli. Nella prima classe sono compresi l'acido caffeico e diversi suoi esteri, tra i quali il più importante è l'acido rosmarinico, ma anche altri acidi fenolici tra cui cumarico, vanillico, clorogenico e ferulico, rilevati in concentrazioni variabili in funzione della cultivar e dello stadio vegetativo della pianta. Alla classe dei flavonoli sono riconducibili composti quali il campferolo, la rutina e la quercitina. Per quanto riguarda l'evoluzione della componente fenolica nel basilico nelle fasi di post-raccolta, trasformazione e conservazione, sono invece disponibili informazioni scarse e spesso frammentarie. Lo scopo di questo lavoro, attualmente ancora in corso, è appunto lo studio dinamico dei principali composti fenolici presenti nel basilico.Sono state sviluppate differenti metodiche per l'estrazione degli analiti di interesse da campioni di basilico fresco e da formulati a base di basilico (basilico, olio, sale). La determinazione dei fenoli è stata realizzata mediante HPLC/MS, utilizzando diverse modalità di acquisizione: in SIM per l'analisi quantitativa e in scansione per la individuazione di eventuali prodotti di neoformazione. Questi ultimi sono stati ulteriormente investigati mediante frammentografia, in modalità Product Ion Scan, confrontando gli spettri di questi prodotti con quelli acquisiti dalle molecole originarie, al fine di interpretare le modificazioni chimiche intervenute L'estrazione degli analiti dai formulati viene realizzata mediante Dispersione della Matrice in Fase Solida (MSPD). Una cartuccia di vetro veniva impaccata con 0.5 g di matrice previamente dispersa in 1.5 g di C18 quale mezzo disperdente; gli analiti erano eluiti con 10 mL di una soluzione metanolo/acqua (80/20) acidificata a pH 2.5 con acido formico. L'eluato viene quindi filtrato e iniettato nel sistema HPLC/MS/MS per l'analisi. La separazione cromatografica è stata realizzata utilizzando un sistema, composto da 2 micropompe HPLC e autocampionatore (Perkin Elmer series 200). Lo spettrometro di massa era un API 2000 (Applied Biosystems) equipaggiato con interfaccia TurboIonSpray, operante in modalità di ionizzazione negativa. Per la determinazione quantitativa dei composti noti i campioni sono stati analizzati in Selected Ion Monitoring. Per la identificazione dei componenti incogniti si è lavorato ugualmente in ionizzazione negativa, ma operando in modalità di scansione delle masse (Full Scan) fino a 800 m/z. Nel caso delle analisi in SIM l'acquisizione veniva effettuata nell'intervallo 0-25 min, sulla base dei tempi di ritenzione delle sostanze analizzate. Per le analisi in Full Scan si è scelto di allargare l'intervallo di acquisizione allo scopo di monitorare anche eventuali prodotti di reazione (condensazione, ossidazione, etc.), che potrebbero, mantenendo analoghe condizioni cromatografiche, essere rivelati a tempi di ritenzione più elevati. Sono stati inoltre effettuati esperimenti in Tandem MS al fine di verificare il pattern di frammentazione degli acidi fenolici e confrontarlo con quello di prodotti di neoformazione. In tal modo è possibile interpretare le modificazioni chimiche avvenute durante lo stoccaggio dei campioni a carico dei composti originari.