猪肺炎支原体168株黏附因子基因的克隆与表达

目的表达猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)168 株黏附因子(P97),探索其作为诊断抗原的可能性.方法采用PCR方法,从猪肺炎支原体168 株基因组DNA中扩增到黏附因子(P97)基因的抗原决定簇序列(R1区),产物经双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,具有正确阅读框架的重组表达质粒pET-32a(+)-P97(R1)转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的基因表达.结果 (1)获得Mhp168株黏附因子基因R1区长约270bp的DNA片段,测序证明重组质粒pET-32a(+)-P97(R1)的外源基因序列与已报告的Mhp232及J株黏附因子基因序列基本一致;(2)SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量26.5kDa处有阳性表达条带,融合蛋白约占细菌蛋白总量的23.3%,主要以可溶性蛋白形式存在;(3)免疫印迹显示,该蛋白条带与兔抗猪肺炎支原体高免血清有阳性反应.结论 Mhp168株黏附因子基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组蛋白具有免疫反应性.