hTEM8-N-RFP融合蛋白真核表达载体的构建及在HEK293F细胞中表达

目的:构建人肿瘤内皮标志物8(hTEM8)胞外区(N端)与红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体并在HEK293F细胞中表达,为进一步研究hTEM8的相互作用蛋白及其在肿瘤血管形成过程中的机制奠定实验基础。方法:以质粒pDsRed-Express-C1和重组质粒pcDNA3.1(+)-hTEM8/Fc为模板,PCR扩增RFP和hTEM8-N基因片段,先后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP,转染HEK293F细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白在转染细胞中的的表达,并用G418对转染的细胞进行加压筛选,Western blot检测hTEM8-N-RFP融合蛋白在转染细胞中的表达。结果:DNA测序、酶切鉴定的结果显示,表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP构建成功,且序列正确。转染后经荧光显微镜观察到HEK293F细胞中有红色荧光,经加压筛选单克隆后,在荧光显微镜下观察到稳定表达红色荧光的细胞株,Western blot检测到融合蛋白hTEM8-N-RFP在真核细胞HEK293F中获得表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP真核表达载体,并在HEK293F细胞中表达,为后期研究hTEM8的相互作用蛋白和其生理功能奠定了良好的基础。