5-Aza-dC在mES细胞向生殖细胞分化中的DNA甲基化调控机制

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)向生殖细胞(Embryonic germ cells,EG)分化过程中5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)对DNA甲基化转移酶Dnmtl和Dnmt3a及生殖细胞特征基因Mvh表达变化的DNA甲基化调控机制.方法:将mES细胞分化形成拟胚体( embryoid bodies,EBs)作为向生殖细胞分化的启动步骤,采用不同浓度(0.05 μnol/L,0.1μmol/L,0.5μmol/L,1 μmol/L,3μmol/L)处理EBs,RT-PCR实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测检测在5 -Aza-dC处理前后Dnmt1和Dnmt3a在ES细胞和EBs中的表达,甲基化特异性PCR(MSP)检测原始生殖细胞分化特征基因Mvh启动子甲基化状态.结果:5-Aza-dC的浓度在0.05μmol/L～1μmol/L之间时,EBs保持较高的存活率而EBs的形态明显发生了变化；5-Aza-dC处理后,Dnmt1和Dnmt3a在EBs中mRNA表达量明显降低,其变化特点与WB结果相一致.MSP和测序结果显示,Mvh启动子区表现为部分甲基化,5-Aza-dC处理后的4d EBs中Mvh CpG岛有4个CG位点发生突变,而mES细胞中未见突变.结论:EBs经5-Aza-dC处理后,Dnmt1和Dnmt3a的表达明显下调；同时,Mvh启动子发生部分甲基化,有可能启动了向生殖细胞的分化进程.