福建道地药材枇杷叶ISSR反应体系的建立与优化

目的建立适于福建产枇杷叶的ISSR分析的PCR反应体系,筛选适宜引物,并确定最佳退火温度。方法改良的CTAB法提取嫩叶中DNA,通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件,利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果适于枇杷叶ISSR最佳的反应体系为:总反应体积为25μL,其中模板DNA 60 ng,Taq DNA聚合酶0.9 U,引物浓度0.4μmol.L?1,dNTP浓度200μmol.L?1,10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,加入灭菌去离子水至25μL。扩增程序为:预变性94℃7 min,变性94℃l min,复性最佳退火温度1 min,延伸72℃1 min,35个循环,72℃延伸10 min。在100条引物中筛选出14条扩增条带清晰且条带数目较多的引物,最佳退火温度为48~58℃(因引物不同而异)。结论建立了枇杷叶ISSR最佳反应体系,筛选出14条引物并确定了最佳退火温度,为应用ISSR技术鉴定枇杷叶的种质资源和遗传多样性研究奠定了基础。