无标签人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基因工程方法构建无标签人源性脂联素球状结构(gAd)基因的原核表达载体,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化及鉴定。方法:从正常人脂肪组织里提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经低温、低浓度IPTG诱导使其可溶性表达,采用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析三步分离纯化,得到不带任何标签的人源性gAd;运用SDS-PAGE、Western印迹、HPLC对重组蛋白进行鉴定,通过对AMP激活的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平检测纯化蛋白的生物学活性。结果:构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的可溶性表达,纯化的蛋白经SDS-PAGE和Western印迹分析证实为gAd,HPLC分析蛋白纯度达到95%以上;通过对AMPK磷酸化水平的检测,证明纯化的gAd具有高生物学活性。结论:重组表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构,为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础。