毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp。通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子。cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORF,长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15。在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394。氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域。将获得的漆酶基因lac1与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带。结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lac1为漆酶基因。