仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。