NR4A1基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 :克隆小鼠孤儿核受体(NR4A1)基因全长cDNA的读码框,构建携带NR4A1基因的重组真核表达载体,为研究其在心肌细胞中的功能做准备。方法:从Pax-8敲除的小鼠心肌组织中提取总RNA,通过逆转录得到总cDNA,利用逆转录PCR法扩增,将目的产物与pGEM-T Easy载体连接,测序分析正确后,再以相同PCR方法扩增,将其与真核表达载体pIERS2-ZsGreen1连接,构建重组质粒。经限制性酶切及测序鉴定后,利用Lipofectamine2000将重组载体pIERS2-ZsGreen1-NR4A1转染到H9C2心肌细胞。实验分三组:①实验组(PZ-NR4A1组):细胞转染1.2μg pIERS2-ZsGreen1-NR4A1重组载体;②阴性对照组(NC组):细胞转染1.2μg pIERS2-ZsGreen1空载体;③空白对照组(BC组):给予的常规培养液,未做其他处理。并用RT-PCR法和Western blotting法检测转染后NR4A1 mRNA和蛋白的表达。结果:成功构建了小鼠pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表达载体。转染重组载体到细胞后,相比BC组(1.00±0.00)和NC组(0.99±0.16),PZ-NR4A1组(2.62±0.21)NR4A1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05),而BC组和NC组mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。PZ-NR4A1组(0.72±0.11)NR4A1蛋白的表达量与BC组(0.17±0.07)和NC组(0.21±0.08)相比,PZ-NR4A1组蛋白表达量明显升高(P<0.05),而BC组和NC组蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论:通过基因重组技术,成功克隆了NR4A1基因,并构建了真核表达载体pIERS2-ZsGreen1-NR4A1,且能够在H9C2心肌细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨NR4A1基因的生物学功能及机制奠定了基础。