三重表达肺结核DNA疫苗在细胞水平的检测

目的:评估整合siRNA、融合抗原基因、hIL-12的新型肺结核DNA疫苗在人胚肾细胞293中三个表达单元独立互不干扰表达。方法在已构建含有靶向抗调亡基因Mcl-1L的siRNA、结核分枝杆菌抗原基因Ag85B-ESAT6(PVAE)、hIL-12三个独立表达单位的新型肺结核DNA疫苗pVAX-siRNA-PVAE-IL-12基础之上,将抗原基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,得到真核表达质粒pVAX1-siRNA-PVAE[EGFP]-hIL12。并将DNA疫苗中的靶向抗凋亡基因Mcl-1L的序列置换为靶向EGFP基因的siRNA序列[siEGFP],得到pVAX1-[siEGFP]-PVAE[EGFP]-hIL12表达质粒。用质粒pVAX1-siRNA-PVAE[EGFP]-hIL12、pVAX1-[siEGFP]-PVAE[EGFP]-hIL12转染人胚肾细胞293,以EGFP为报告基因,分别证实融合抗原基因与siRNA编码序列的表达。以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达。结果经酶切鉴定和测序证实肺结核DNA疫苗改造成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实了融合抗原基因的表达。对照组证实了siRNA编码序列表达的抑制效果。转染48h后细胞培养液中hIL-12的检出量为1571.63pg/ml;72h后细胞培养液中hIL-12的检出量为2392.25pg/ml。结论已构建的肺结核DNA疫苗能在真核细胞中有效表达siRNA、抗原基因与hIL-12。为进一步研究该DNA疫苗抗肺结核的免疫保护率和基因治疗效果打下基础。