RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的:利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒,筛选有效的抑制序列后,研究其对HSC-T6中TGF-β1、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列,构建重组体成功后转染HSC-T6,24h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平,筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6,培养24、48h后用RT-PCR和/或Westernblotting检测各组细胞中TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后,筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列;pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达,降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05),而对TGF-β1的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTG-FshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。