利用改进的手工克隆技术生产转GFP基因猪克隆胚胎

通过体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)培育转基因动物新个体是当前被广泛使用的技术之一,但其生产成本高和转基因囊胚形成率低在很大程度上制约了该技术的应用.文章报告对该技术的一些改进以提高其成功率并降低成本.首先将增强型绿色荧光基因(EGFP)导入猪胎儿成纤维细胞中,通过荧光观察EGFP的表达来筛选适合做细胞核移植的体细胞.这样避免了外源EGFP基因虽已整合至猪基因组但不表达的情况,保证供体细胞100%是表达目标蛋白(绿色荧光蛋白)的细胞;然后利用新一代体细胞核移植技术--寻工克隆技术(Handmade cloning,HMC)将供体细胞与卵母细胞融合生产胚胎.共收集了4个批次378个肉用家猪的卵母细胞,经体外培养成熟后手工去核得到266个去核卵母细胞,与EGFP细胞融合后获得127个重构胚胎,将重构胚胎体外培养到144 h,得到转基因囊胚65个,平均囊胚率为52.1±8.3%.与传统SCNT相比,HMC不仅操作简便,而且能大幅提高核移植细胞的囊胚率.更为重要的是,改进的手工克隆技术摆脱了昂贵的显微操作仪,为产业化生产转基因动物提供了新的实用基础.