稳定表达绿色荧光的大鼠胚胎来源肝干细胞

背景:胎肝来源肝干细胞作为细胞移植的供体来源具有优势,但有鉴于干细胞特质,其培养困难,传代后易分化生长;且现有干细胞示踪定位技术欠成熟,这些均是制约肝干细胞移植的重要因素。目的:观察原代肝干细胞电转pEGFP-Cl质粒是否能获得稳定表达绿色荧光的肝干细胞。方法:联合机械分离和胶原酶消化法体外分离孕13.5dSD大鼠胚胎来源肝细胞,应用特异培养基培养分离细胞,随后通过半量换液法纯化出肝干细胞,采用细胞免疫荧光法对贴壁细胞进行鉴定,并用pEGFP-Cl质粒电转染原代肝干细胞后持续表达绿色荧光作示踪定位标志。结果与结论:原代培养的胎肝干细胞24h后可见细胞半贴壁,形态基本相同,呈圆形或卵圆形;第2天观察细胞为大小几乎一致的圆形;培养第3天出现一些由3,5个形态一致的细胞集落,细胞直径6～10μm;细胞集落不断增大,至第5天集落中细胞数量增至10个左右,集落由大小不等的致密圆形细胞组成,界限清楚;第8天后细胞呈上皮样铺展;第12天时,细胞变大呈煎蛋样摊开,形态不规则,细胞浆内可见颗粒,生长变得缓慢;传代后细胞扩增速度无明显变化,至第3代仍保持较均一的上皮细胞状;通过细胞免疫荧光法检测出培养第5天的贴壁细胞表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19;经筛选pEGFP-Cl质粒电转染后的原代肝干细胞能稳定表达绿色荧光。实验成功构建转染了绿色荧光蛋白的肝干细胞。