脂质体转染survivin反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对人胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向ASODN及正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,SODN)。ASODN经FAM标记,以阳离子脂质体为载体转染至体外培养的PANC-1细胞中(ASODN组),另设空白对照组(正常培养的细胞)、脂质体空转染组(脂质体转染的为正常的培养基)及SODN组作为对照组。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测转染率,依次筛选最佳细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体的量;荧光显微镜观察转染后的细胞;MTT法测定转染后细胞的抑制率;透射电镜观察转染后细胞的超微结构变化;吖叮橙(AO)与溴化乙啶(EB)染色观察转染后细胞凋亡的形态学改变;DNA凝胶电泳观察转染后细胞凋亡情况;FCM测转染后细胞凋亡率及细胞周期;免疫组织化学技术检测转染后survivin蛋白的表达。结果①ASODN浓度为50、100、150、200、250、400、600及800 nmol/L时,转染率分别为31.9%、37.4%、41.4%、52.6%、24.2%、11.4%、16.1%和15.5%;接种细胞数量为2×104、2×105及2×106个/孔时,转染率分别为12.0%、50.8%和11.2%;转染所用的脂质体量为2、3及4μl时,转染率分别为58.8%、34.0%和23.6%。②转染ASODN后荧光显微镜发现转染后细胞之间空隙加大,形态变圆,贴壁细胞生长较少,部分漂浮于培养液中。③ASODN组24、36及48 h后细胞抑制率明显高于各对照组(P<0.05),随着时间延长,细胞抑制率增高(P<0.05)。④ASODN组电泳图上凋亡细胞呈明显的"梯状"条带。⑤AO与EB染色观察ASODN组细胞出现凋亡的形态学改变,其核染色质均高度聚集或核染色呈新月形聚集于核膜一边,核仁消失。⑥ASODN组细胞凋亡率为(38.10±3.4)%,明显高于SODN组的(4.16±1.7)%(P<0.05)。⑦ASODN组细胞周期阻滞于G2/M期。⑧转染后ASODN组survivin蛋白表达明显低于各对照组(P<0.05)。结论 survivin ASODN转染至胰腺癌细胞最佳转染条件为接种细胞数量为2×105个/孔,ASODN的浓度为200 nmol/L,脂质体的量为2μl;survivin ASODN能明显下调survivin蛋白的表达,抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。