龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠血清雌二醇浓度及膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的:观察龟鹿二仙胶及其拆方对去势骨关节炎大鼠血清雌二醇浓度及膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。方法:采用抽签法将168只4月龄雌性SD清洁级大鼠随机分为2组,手术造模组141只,假手术组27只。切除手术造模组大鼠双侧的卵巢和双侧膝关节的内侧副韧带和前交叉韧带,制造肝肾亏虚型骨关节炎大鼠模型;切除假手术组大鼠双侧卵巢附近的脂肪组织。每天驱赶实验大鼠1 h,连续驱赶4周。4周后分别从手术造模组与假手术组各取5只大鼠,采用HE染色和甲苯胺蓝染色法观察子宫与膝关节软骨的组织形态学变化,采用甲苯胺蓝染色法观察膝关节软骨基质中糖胺聚糖的表达情况,采用放射免疫法测定血清雌二醇浓度,鉴定大鼠模型。造模成功后将假手术组作为空白对照组(空白组),并将其分为干预2、4、8周的3小组,每组7只,留1只备用;采用抽签法将手术造模组随机分为6组,即模型对照组(模型组)、龟鹿二仙胶组(全方组)、龟甲鹿角组(龟鹿组)、龟甲鹿角人参组(龟鹿参组)、龟甲鹿角枸杞组(龟鹿杞组)、盐酸氨基葡萄糖对照组(盐酸氨基葡萄糖组),再分别将每组分为干预2、4、8周的3小组,每组7只,留10只备用。参照人与大鼠药物等效剂量换算公式,将龟甲胶、鹿角胶、人参、枸杞、盐酸氨基葡萄糖分别配成浓度为81 mg.mL-1、54 mg.mL-1、10.8 mg.mL-1、27 mg.mL-1、13.5 mg.mL-1的药液。各组大鼠均以10mL.kg-1体质量以各组药液灌胃,空白组与模型组以生理盐水灌胃;全方组以配成的龟鹿二仙胶混合液灌胃;龟鹿组以配成的龟甲胶和鹿角胶混合液灌胃;龟鹿参组以配成的龟甲胶、鹿角胶与人参混合液灌胃;龟鹿杞组以配成的龟甲胶、鹿角胶、枸杞子混合液灌胃;盐酸氨基葡萄糖组以配成的盐酸氨基葡萄糖溶液灌胃。每天灌胃1次,各组分别连续灌胃2、4、8周。药物干预结束后,从腹主动脉抽血后处死大鼠,取出的血经静置、离心后吸取上层血清,保存待检;取出大鼠右侧中下1/3段股骨,制备石蜡标本。采用放射免疫法检测大鼠血清雌二醇浓度,采用免疫组化染色法观察关节软骨中Ⅱ型胶原的表达。结果:①形态观察。手术造模组与假手术组大鼠的子宫与膝关节软骨的组织形态学变化显示手术造模组造模成功。②药物干预前血清雌二醇浓度和膝关节软骨基质中糖胺聚糖含量。药物干预前,手术造模组的血清雌二醇浓度明显低于假手术组[(87.130±39.720)ng.L-1,(195.080±42.449)ng.L-1;t=4.152,P=0.003];手术造模组的软骨基质中糖胺聚糖含量低于假手术组[(0.239±0.066),(0.597±0.053);t=9.457,P=0.000]。显示手术造模组造模成功。③药物干预后血清雌二醇浓度。用药2周后,各组间血清雌二醇浓度比较,差异有统计学意义[(204.082±50.995)ng.L-1,(80.191±29.921)ng.L-1,(129.583±48.763)ng.L-1,(121.223±51.514)ng.L-1,(117.582±50.131)ng.L-1,(128.181±45.987)ng.L-1,(114.479±39.346)ng.L-1;F=4.520,P=0.001]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.002,P=0.001,P=0.001,P=0.003,P=0.001);模型组低于全方组(P=0.039);其余各组间血清E2浓度比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。用药4周后,各组间血清雌二醇浓度比较,差异有统计学意义[(204.819±53.802)ng.L-1,(91.613±32.654)ng.L-1,(148.727±51.860)ng.L-1,(146.576±32.976)ng.L-1,(145.225±49.217)ng.L-1,(146.365±45.800)ng.L-1,(132.197±46.032)ng.L-1;F=4.278,P=0.002]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.022,P=0.013,P=0.015,P=0.013,P=0.002);模型组低于全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组(P=0.027,P=0.027,P=0.037,P=0.027);其余各组间血清E2浓度比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。用药8周后,各组间血清雌二醇浓度比较,差异有统计学意义[(192.060±57.040)ng.L-1,(97.504±40.006)ng.L-1,(183.140±50.887)ng.L-1,(130.757±39.285)ng.L-1,(167.763±32.878)ng.L-1,(158.112±48.309)ng.L-1,(112.494±46.687)ng.L-1;F=3.296,P=0.009]。组间两两比较,空白组高于模型组、龟鹿组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.011,P=0.001);模型组低于全方组、龟鹿参组、龟鹿杞组(P=0.002,P=0.005,P=0.012);全方组高于盐酸氨基葡萄糖组(P=0.010);其余各组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。④药物干预后膝关节软骨基质中Ⅱ型胶原的表达量。用药2周后,各组间膝关节软骨基质中Ⅱ型胶原的表达量比较,差异有统计学意义[(0.598±0.096),(0.226±0.113),(0.310±0.070),(0.310±0.072),(0.311±0.075),(0.296±0.081),(0.389±0.068);F=33.533,P=0.000)]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);模型组低于全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.007,P=0.006,P=0.006,P=0.021,P=0.000);全方组低于盐酸氨基葡萄糖组(P=0.008)。其余各组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。用药4周后,各组间膝关节软骨基质中Ⅱ型胶原的表达量比较,差异有统计学意义[(0.603±0.083),(0.223±0.113),(0.387±0.090),(0.270±0.083),(0.371±0.059),(0.300±0.081),(0.442±0.067);F=37.064,P=0.000]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);模型组低于全方组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.011,P=0.000);全方组高于龟鹿组、龟鹿杞组(P=0.000,P=0.003)。其余各组间Collagen-Ⅱ表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。用药8周后,各组间软骨基质中Ⅱ型胶原的表达量比较,差异有统计学意义[(0.608±0.067),(0.217±0.106),(0.437±0.065),(0.263±0.110),(0.380±0.073),(0.273±0.081),(0.443±0.068);F=42.071,P=0.000]。组间两两比较,空白组高于模型组、全方组、龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);模型组低于全方组、龟鹿参组、盐酸氨基葡萄糖组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);全方组高于龟鹿组、龟鹿参组、龟鹿杞组(P=0.000,P=0.049,P=0.000);其余各组间Collagen-Ⅱ表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:在提高血清雌二醇浓度方面,龟甲胶与鹿角胶配伍人参或枸杞均是有效配伍,且用药2周时配伍人参和枸杞的效果要优于单独配伍人参或单独配伍枸杞。但随着用药时间的延长,龟甲胶与鹿角胶配伍人参提高雌二醇浓度的效果好还是配伍枸杞的效果好,还是龟鹿二仙胶全方效果好,仍需进一步研究证实。在促进膝关节软骨基质中Ⅱ型胶原表达方面,人参和枸杞在龟鹿二仙胶方中发挥了不可缺少的作用。