IDO基因重组慢病毒载体构建及其转染hUCMSCs细胞的实验研究

目的构建共同表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体,探讨其在人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)中的表达,为下一步利用高表达IDO的hUCMSCs移植治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法将IDO基因克隆至慢病毒pGC-FU-EGFP表达载体中,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。重组慢病毒表达载体质粒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;制备携带IDO基因的慢病毒Lentivirus-IDO,并测定重组慢病毒的滴度。用重组慢病毒以最佳MOI值感染hUCM-SCs作为实验组,以空载体转染的hUCMSCs(空载体组)及未转染的hUCMSCs(未转染组)作为对照,应用RT-PCR及Western blot法分别检测细胞中IDO mRNA及IDO蛋白水平的表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定pGC-FU-EGFP-IDO重组慢病毒表达载体构建成功,包装慢病毒Lentivirus-IDO滴度为2×108 TU/mL。通过EGFP表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为30,此时对细胞的转染效率可达到80%以上。RT-PCR检测显示实验组IDO mRNA表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性;Western blot检测示实验组细胞内IDO蛋白表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性。结论成功构建了人IDO基因的重组慢病毒表达载体,慢病毒Lentivirus-IDO能有效感染hUCMSCs,IDO蛋白可在hUCMSCs中长期、稳定表达。