小干扰RNA抑制人端粒酶逆转录酶基因对恶性转化后骨髓间充质干细胞的影响

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)抑制人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表达对恶性转化后骨髓间充质干细胞(transformed mesenchymal stem cells,TMCs)增殖和在动物体内成瘤能力的影响。方法:构建针对hTERT的siRNA,通过脂质体转染的方法将hTERT-siRNA转染TMCs。实验组为3个浓度组,分别为50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L,设阴性对照组和空白对照组。用噻唑蓝(MTT)法检测siRNA对TMCs生长增殖的影响。用Westernblot法检测各浓度组TMCs端粒酶的含量。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各浓度组hTERT mRNA含量,并用TRAP-ELISA法检测各浓度组TMCs端粒酶的活性。用BALA/C裸鼠体内实验检测siRNA转染后各组TMCs在动物体内成瘤能力的变化。结果:通过Western blot,发现不同浓度的hTERT-siRNA组TMCs的端粒酶蛋白含量逐渐减少,与siRNA的浓度呈负相关。50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L组分别下降了46.2%、69.5%、91.5%;MTT法检测3个浓度组hTERT-siRNA对细胞的生长抑制率分别为2.74%、7.26%、10.23%。其中50nmol/L组和对照组之间差异无统计学意义,而100nmol/L组和200nmol/L组与阴性对照组之间差异有统计学意义。RT-PCR检测结果显示50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L hTERT-siRNA转染组hTERT基因分别下降了19.2%、47.2%、86.4%。端粒重复序列扩增(TRAP)-酶联免疫吸附试验(ELISA)法检查发现,不同浓度的hTERT-siRNA对TMCs的端粒酶活性都产生抑制作用,3组分别下降了11.0%、42.9%、86.2%。100nmol/L组和对照组TMCs在裸鼠皮下形成肿瘤的时间相似,分别为14.8d、14.2d;200nmol/L组成瘤时间较晚,为17.3d。对照组形成的皮下肿瘤体积和质量分别为2.56cm3、1.30g;而100nmol/L和200nmol/L组肿瘤体积分别为0.64cm3、0.31cm3,质量分别为0.78g、0.58g,与对照组间相比差异有统计学意义。结论:siRNA可以下调hTERT基因的表达,减少TMCs细胞内端粒酶的含量,也降低了端粒酶的活性,从而增加了TMCs的凋亡、抑制了TMCs的生长,并降低了TMCs在裸鼠体内的成瘤能力。端粒酶在MSCs恶性转化的过程中可能起了重要的作用。