不同分子区域的Caveolin-1真核表达载体构建及其对Caveolin-1基因敲除小鼠系膜细胞周期的影响

目的:构建含不同分子区域的caveolin-1真核表达质粒,转染caveolin-1基因敲除小鼠(Cav-1-/-)的肾小球系膜细胞,观察能否逆转系膜细胞周期阻滞.方法:首先从pLHCX-N-FLAG2/caveolin-1全长质粒中扩增cave-olin-1 N末端(第1-82位氨基酸)、N末端+脚手架区(第1-101位氨基酸)的cDNA片段,同时在引物两端加上限制性酶切位点Hind Ⅲ及Xho Ⅰ,再与复制缺陷型逆转录病毒表达载体pLHCX-N-FLAG3连接.完成酶切和测序鉴定后将pLHCX-N-FLAG3/cav-1-82和pLHCX-N-FLAG3/cav-1-101分别转染HEK293T细胞,包装产生有感染力的病毒颗粒,再分别感染Car-1-/-系膜细胞,流式细胞分析观察能否逆转细胞周期阻滞.结果:成功构建含caveolin-1 N末端、N末端+脚手架区片段的重组真核表达载体,流式细胞分析发现pLHCX-N-FLAG3/cav-1-82和pLH-CX-N-FLAG3/cav-1-101基因导入Cav-1-/-系膜细胞,可逆转G0/G1细胞周期阻滞.Vcaveolin-1可能主要通过N末端第1-82位氨基酸区域参与细胞周期进程,具体机制还需进一步研究.